Tris-醋酸-SDS-PAGE电泳试剂盒(含塑料板预制胶,变性电泳) Ver.760558-3.0
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货号
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名称
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规格
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RTD6155P
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Tris-醋酸-SDS-PAGE电泳试剂盒(含塑料板预制胶,变性电泳)
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10次
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● 产品组成：
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序号
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货号
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名称
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规格
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保存
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1
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RTD6154-0308P
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3-8%
RealPAGE Tris醋酸预制胶 (塑料板）
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10板/盒
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4℃
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2
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TA1510
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400×抗氧化剂
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15 mL
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4℃
(配制后-20℃贮存)
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3
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TA050
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10×Tris-醋酸-SDS电泳缓冲液(变性电泳,溶液型）
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500 mL
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RT
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4
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PL080-01
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5×MonoClolor蛋白上样缓冲液 (变性，还原)
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1 mL
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-20℃
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5
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RTD6202-02
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FastBlue蛋白快速染色液
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500 mL
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RT
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6
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RT5050
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10×湿转转膜缓冲液(适用Tris醋酸胶高分子量蛋白)
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500 mL
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4℃
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7
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说明书
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一份
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-
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● 产品简介：
Tris-醋酸-SDS-PAGE凝胶电泳适合于分离高分子量蛋白，可以有效分离50-500 kDa范围内蛋白；电泳体系接近中性，有助于减少蛋白中巯基的氧化及二硫键重新形成；在变性还原电泳时，电泳缓冲液中加入抗氧化剂，使电泳过程中保持还原环境，进一步减少二硫键重新形成。
本试剂盒包含预制胶以及蛋白上样、电泳、染色和湿转所需试剂，可完成 10次电泳实验和5次湿转实验。
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技术规格
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塑料胶板尺寸
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10×8.2 cm
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凝胶尺寸及厚度
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凝胶尺寸8.2×7.2 cm，胶厚度约1.1 mm
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梳孔
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12齿
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凝胶浓度
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梯度浓度3-8%
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推荐上样体积
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最优上样体积10-20 μL，最大上样体积35 μL
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检测分子量范围
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最佳分离范围50-500 kDa
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推荐染色方法
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推荐使用FastBlue蛋白染色液（RTD6202）快染
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电泳缓冲液
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Tris-醋酸-SDS电泳缓冲液（TA050，TA050P，TA060）
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推荐上样缓冲液
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5×MonoClolor 蛋白上样缓冲液（变性，还原）（PL080）
5×速溶型蛋白上样缓冲液（PL120，PL121）
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推荐电泳条件
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恒压 150 V至电泳结束，电泳时间约60 min
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转膜
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10×湿转转膜缓冲液(适用Tris醋酸胶高分子量蛋白)（RT5050）
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适用范围
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蛋白变性电泳，不推荐用于非变性电泳。
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● 贮存、运输及效期：
各组分按照标签标示温度贮存，预制胶不可冷冻。试剂盒可常温运输，有效期为1个月。
● 使用说明：
1. 实验准备：
400×抗氧化剂为干粉，常温贮存。用前加入15 mL超纯水震荡彻底溶解后使用，已经溶解的400×抗氧化剂-20℃贮存。
2. 电泳：
2.1 拆开预制胶包装，撕掉底部胶条，拔掉梳子，梳孔朝下轻甩胶板，去除胶孔中可能有的残胶，将预制胶安装在合适的电泳槽中。
注：伯乐Mini III或Mini-PROTEAN Tetra Cell，天能VE-180，六一24K系列电泳槽请确保密封条的安装方向（如图1-4）。六一其他系列，君意东方JY-SCZ2/4，百晶BG-verMINI等电泳槽可以直接使用预制胶。不兼容Thermol系列电泳槽。
2.2 准备1×电泳缓冲液：
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1000
mL
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10×Tris-醋酸-SDS电泳缓冲液(变性电泳，溶液型）（TA050）
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100 mL
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超纯水
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900 mL
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2.2.1 外槽缓冲液：取适量体积1×电泳缓冲液用于外槽缓冲液。
2.2.2 内槽缓冲液：按照每 200 mL 1×电泳缓冲液加入0.5 mL 400×抗氧化剂的比例配制，混合均匀后用于内槽缓冲液。
2.3准备上样样品：
待测样品与5×MonoColor蛋白上样缓冲液（变性、还原）（PL080）按 4:1（v/v） 混合，95℃加热5 min。对于多次跨膜蛋白（multi-pass membrane protein），建议采用 37℃ 30 min或50℃ 10 min 处理，避免95℃高温加热。高温处理可能导致疏水性膜蛋白聚集，从而在WB中出现高分子量聚集条带。
2.4电泳：
在电泳槽内槽加入1×内槽电泳缓冲液（含抗氧化剂），使用1 mL移液器冲洗加样孔3次；随后在外槽加入适量1×外槽电泳缓冲液。加入样品后开始电泳。
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恒电压
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起始电流
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结束电流
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电泳时间
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150 V
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40-55 mA/板胶
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25-40 mA/板胶
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~60 min
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注：恒压运行时无需调节电流，电流通常随电泳进行逐渐下降，可观察并记录电流变化。建议按照推荐电压运行。提高电压会增加凝胶及电泳缓冲液的焦耳热，可能导致蛋白条带弯曲、扩散或分辨率下降。电泳过程中如缓冲液温度明显升高，可适当降低电压或采取冷却措施。
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3. 染色：
3.1
将电泳后的PAGE胶取下放入塑料容器中，加入适量染色液，以完全覆盖凝胶为宜。对于蛋白含量较高的条带（≥1
μg/条带），染色
1–2 min 即可观察到明显条带。
3.2 摇床上常温摇动10-15分钟，至条带清晰可见满足实验要求后停止染色。
3.3
蒸馏水漂洗凝胶，在蒸馏水中脱色摇动10-15分钟，至凝胶基本无蓝色背景，拍照记录结果。
4. 转膜：
4.1 转印膜选择：
Tris-醋酸凝胶转膜可以使用NC膜和PVDF膜，需要选择0.45 μm孔径。PVDF膜使用前注意需要用甲醇润湿活化。
4.2 准备1×转膜缓冲液：
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1×即用型转膜缓冲液(1升)
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10×湿转转膜缓冲液(适用Tris醋酸胶高分子量蛋白)
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100
mL
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50-500 kDa
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超纯水
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约500
mL
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无水甲醇或乙醇（终浓度10%（v/v））
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100 mL
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超纯水
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定容至1升
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4.3 转膜条件：
以下条件仅供参考。不同目的蛋白的最佳转膜条件可能存在差异，建议根据蛋白分子量及实验结果进行优化。
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膜孔径
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蛋白大小
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恒流
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建议时间
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降温措施
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0.45
μm
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50-500
kDa
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400
mA
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40-60
min
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全程低温
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注：参考电压约80–90
V，实际电压随转膜体系、电泳槽及温度等因素变化。
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5. 实验示例：
5.1 3-8%Tris醋酸胶考染结果：
凝胶：3-8% Tris-醋酸预制胶（RTD6154-0308P）
电泳条件：1×Tris-醋酸-SDS电泳缓冲液，恒压150 V，电流变化49-30 mA，电泳时间65 min
染色：FastBlue快速染色液（RTD6202），染色30 min
5.2 3-8%Tris醋酸胶WB检测结果：
样品1：K562-IP-TP。K562细胞使用Western及IP细胞裂解液（WL1020）提取总蛋白；
样品2：Jurkat-RIPA-TP。Jurkat细胞使用RIPA裂解液（强）（RL1020）提取总蛋白；
样品处理：5×双色蛋白上样缓冲液 (变性，还原）（PL090），95度 5 min，样品1和2上样20 μg；
Marker：三色预染高分子量蛋白Marker III(25-400 kDa)（RTD6151），ECL发光Marker II（22-154 kDa）(RTD6129)，彩虹预染宽分子量蛋白Marker（10-260 kDa）（RTD6106），上样各5 μL；
电泳：3-8% RealPAGE
Tris-醋酸预制胶(RTD6154-0308),
1×Tris-醋酸-SDS电泳缓冲液（加抗氧化剂）（TA050），恒压150 V 51-44 mA 70 min(左图)；转膜：1×湿转转膜缓冲液（RT5050）加10%乙醇；0.45 μm PVDF膜； 恒流400 mA转膜40 min，电压变化84–88 V，全程冰浴并搅拌降温（中图）；封闭：Western封闭液I（BSA）（WB1070） RT 60 min；抗体：p-ACC兔单抗 CST#3661S 1：1000 4℃过夜孵育；二抗-Jackson羊抗兔IgG-HRP 1:5000 RT 60 min；ECL发光检测（右图）：K562样品中检测到约250 kDa的p-ACC特异性条带；本实验条件下Jurkat样品未检测到明显p-ACC条带。