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酶切位点保护碱基-PCR引物设计用于限制性内切酶

本文给出了分子克隆中常用限制性内切酶的保护碱基序列,如 AccI AflIII AscI AvaI BamHI BglII BssHII BstEII BstXI ClaI EcoRI HaeIII HindIII KpnI MluI NcoI NdeI NheI NotI NsiI PacI PmeI PstI PvuI SacI SacII SalI ScaI SmaI SpeI SphI StuI XbaI XhoI XmaI

 

为什么要添加保护碱基?

在分子克隆实验中,有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点,用于后续的酶切和连接反应。由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开,因此在设计 PCR 引物时,人为的在酶切位点序列的 5 端外侧添加额外的碱基序列,即保护碱基,用来提高将来酶切时的活性。其次,在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时,相临的两个酶切位点往往不能同时使用,因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。

 

该如何添加保护碱基?

添加保护碱基时,最关心的应该是保护碱基的数 目,而不是种类。什么样的酶切位点,添加几个保护碱基,是有数据可以参考的。

添加什么保护碱基,如果严格点,是根据两条引物的 Tm 值和各引物的碱基分布及 GC 含量。如果某条引物 Tm 值偏小, GC% 较低,添加时多加 G C ,反之亦反。

 

为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求, NEB 采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助(比如在多接头上切割位点很接近时),或者当切割位点靠近 DNA 末端时也很有用。在本表中没有列出的酶,则通常需在识别位点两端至少加上 6 个保护碱基,以确保酶切反应的进行。

 

 

寡核苷酸序列

切割率 %

 

2 hr

20 hr

 

Acc I

G GTCGAC C 
CG GTCGAC CG 
CCG GTCGAC CGG

0 
0 
0

0 
0 
0

 

Afl III

C ACATGT G 
CC ACATGT GG 
CCC ACATGT GGG

0 
>90 
>90

0 
>90 
>90

 

Asc I

GGCGCGCC 
A GGCGCGCC T 
TT GGCGCGCC AA

>90 
>90 
>90

>90 
>90 
>90

 

Ava I

C CCCGGG G 
CC CCCGGG GG 
TCC CCCGGG GGA

50 
>90 
>90

>90 
>90 
>90

 

BamH I

C GGATCC G 
CG GGATCC CG 
CGC GGATCC GCG

10 
>90 
>90

25 
>90 
>90

 

Bgl II

C AGATCT G 
GA AGATCT TC 
GGA AGATCT TCC

0 
75 
25

0 
>90 
>90

 

BssH II

G GCGCGC C 
AG GCGCGC CT 
TTG GCGCGC CAA

0 
0 
50

0 
0 
>90

 

BstE II

G GGT(A/T)ACC C

0

10

 

BstX I

AACTGCAGAA CCAATGCATTGG 
AAAACTGCAG CCAATGCATTGG AA 
CTGCAGAA CCAATGCATTGG ATGCAT

0 
25 
25

0 
50 
>90

 

Cla I

C ATCGAT G 
G ATCGAT C 
CC ATCGAT GG 
CCC ATCGAT GGG

0 
0 
>90 
50

0 
0 
>90 
50

 

EcoR I

G GAATTC C 
CG GAATTC CG 
CCG GAATTC CGG

>90 
>90 
>90

>90 
>90 
>90

 

Hae III

GG GGCC CC 
AGC GGCC GCT 
TTGC GGCC GCAA

>90 
>90 
>90

>90 
>90 
>90

 

Hind III

C AAGCTT G 
CC AAGCTT GG 
CCC AAGCTT GGG

0 
0 
10

0 
0 
75

 

Kpn I

G GGTACC C 
GG GGTACC CC 
CGG GGTACC CCG

0 
>90 
>90

0 
>90 
>90

 

Mlu I

G ACGCGT C 
CG ACGCGT CG

0 
25

0 
50

 

Nco I

C CCATGG G 
CATG CCATGG CATG

0 
50

0 
75

 

Nde I

C CATATG G 
CC CATATG GG 
CGC CATATG GCG 
GGGTTT CATATG AAACCC 
GGAATTC CATATG GAATTCC 
GGGAATTC CATATG GAATTCCC

0 
0 
0 
0 
75 
75

0 
0 
0 
0 
>90 
>90

 

Nhe I

G GCTAGC C 
CG GCTAGC CG 
CTA GCTAGC TAG

0 
10 
10

0 
25 
50

Not I

TT GCGGCCGC AA 
ATTT GCGGCCGC TTTA 
AAATAT GCGGCCGC TATAAA 
ATAAGAAT GCGGCCGC TAAACTAT 
AAGGAAAAAA GCGGCCGC AAAAGGAAAA

0 
10 
10 
25 
25

0 
10 
10 
90 
>90

Nsi I

TGC ATGCAT GCA 
CCA ATGCAT TGGTTCTGCAGTT

10 
>90

>90 
>90

Pac I

TTAATTAA 
G TTAATTAA C 
CC TTAATTAA GG

0 
0 
0

0 
25 
>90

Pme I

GTTTAAAC 
G GTTTAAAC C 
GG GTTTAAAC CC 
AGCTTT GTTTAAAC GGCGCGCCGG

0 
0 
0 
75

0 
25 
50 
>90

Pst I

G CTGCAG C 
TGCA CTGCAG TGCA 
AA CTGCAG AACCAATGCATTGG 
AAAA CTGCAG CCAATGCATTGGAA 
CTGCAG AACCAATGCATTGGATGCAT

0 
10 
>90 
>90 
0

0 
10 
>90 
>90 
0

Pvu I

C CGATCG G 
AT CGATCG AT 
TCG CGATCG CGA

0 
10 
0

0 
25 
10

Sac I

C GAGCTC G

10

10

Sac II

G CCGCGG C 
TCC CCGCGG GGA

0 
50

0 
>90

Sal I

GTCGAC GTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC 
GC GTCGAC GTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG 
ACGC GTCGAC GTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA

0 
10 
10

0 
50 
75

Sca I

G AGTACT C 
AAA AGTACT TTT

10 
75

25 
75

Sma I

CCCGGG 
C CCCGGG G 
CC CCCGGG GG 
TCC CCCGGG GGA

0 
0 
10 
>90

10 
10 
50 
>90

Spe I

G ACTAGT C 
GG ACTAGT CC 
CGG ACTAGT CCG 
CTAG ACTAGT CTAG

10 
10 
0 
0

>90 
>90 
50 
50

Sph I

G GCATGC C 
CAT GCATGC ATG 
ACAT GCATGC ATGT

0 
0 
10

0 
25 
50

Stu I

A AGGCCT T 
GA AGGCCT TC 
AAA AGGCCT TTT

>90 
>90 
>90

>90 
>90 
>90

Xba I

C TCTAGA G 
GC TCTAGA GC 
TGC TCTAGA GCA 
CTAG TCTAGA CTAG

0 
>90 
75 
75

0 
>90 
>90 
>90

Xho I

C CTCGAG G 
CC CTCGAG GG 
CCG CTCGAG CGG

0 
10 
10

0 
25 
75

Xma I

C CCCGGG G 
CC CCCGGG GG 
CCC CCCGGG GGG 
TCCC CCCGGG GGGA

0 
25 
50 
>90

0 
75 
>90 
>90

 

注释:

1.如果要加在序列的5’端,就在酶切位点识别碱基序列(红色)的5’端加上相应的碱基(黑色),相同如果要在3‘端加保护碱基,就在酶切位点识别碱基序列(红色)的3’端加上相应的碱基(黑色)。

2.切割率:正确识别并酶切的效率

3. 加保护碱基时最好选用切割率高时加的相应碱基。